2024届高三二轮复习生物：PCR课件

PCR 小专题梳理 利用PCR获取和扩增目的基因 ①原理：DNA复制（DNA半保留复制）。 ②条件：DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。 ③扩增过程 过程 说明 图解 高温变性 温度超过90 ℃，双链DNA解聚为单链 低温复性 温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 中温延伸 温度上升到72 ℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 模板、原料、能量、酶、1对引物 PCR S z L w h S z L w h S z L w h 易错提醒 (1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成　　　　　的原料，又可为DNA的合成提供　　。 (2)引物既可以是DNA单链，也可以为　　　　　。细胞内的DNA进行复制时，也需要　　，一般为RNA片段。 (3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要　　　激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加　　　。 DNA子链 能量 RNA单链 引物 Mg2＋ Mg2＋ PCR技术和DNA复制的比较 S z L w h S z L w h 关于引物 一、引物是什么? 引物是一小段单链的核酸,作为新子链的合成起点,只能结合在母链的3’端;可以是DNA也可以是RNA（依据目的基因两端序列，设计出的2种特异性的引物） 二、为什么要设计（加入）引物？ DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA链。 三、引物的作用？ 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 1.引物的长度一般在15~30bp，否则会影响扩增的特异性。 太短则特异性不够强；太长则退火温度会比较高。（C-G） 2.设计两种引物时,二者之间的碱基序列不能互补配对。 两条引物之间不能有连续4个碱基的互补配对，否则加入的引物自身形成双链而得不到目的基因片段。 3.一条引物自身不能有较多自身互补序列（或反向重复序列）。 如果这种结构在PCR条件下稳定，它会非常有效地阻止引物和模板之间的退火。 4.引物设计应具有特异性（针对核酸系列保守区内设计） 有必要在DNA数据库中进行检测，以确保引物中的序列只在所扩增的基因中出现，而与其他基因不具有互补性，避免产生过多非特异性片段 5.引物中GC含量以40%~60%为宜，太少扩增效果不佳；过多则易出现非特异性条带。4种碱基最好随机分布。 6.两条引物的退火温度相差不能大于5℃。如果相差太大，操作时一般选择较低的那个退火温度，那么另一条引物的非特异性结合就会增加。 四、引物设计的原则？ 尽管有很多因素可影响PCR扩增反应的效率与特异性但最关键的因素是引物的设计。 引物设计的首要目标是其特异性，只有当每条引物都能特异性地与模板DNA中的靶序列退火（复性）形成稳定的结构时才能达到这个目的。 1、为了便于将扩增的DNA片段与运载体连接,可如何操作？ 在引物的5’端 加上限制酶识别序列 2、在两种引物上设计加入不同的限制酶识别序列,主要目的是？ 使目的基因定向（正确）插入载体并避免目的基因自身环化 3、为保证模板链与引物结合的效率，怎么做？ 两种引物之间尽量避免存在互补序列 4、引物的3‘端和5‘端哪个能改造？ 引物的3‘端为结合模板DNA的关键碱基,一般不能改造，5'端无严格限制,可用于添加限制酶切割位点等序列 五、关于引物的一些利用 S z L w h S z L w h 一次成功的DNA片段扩增应该产生与预期大小一致的DNA片段。若出现与预期不一致的结果，可尝试从以下几个方面进行分析：模板DNA的制备、引物的质量与特异性、酶的质量以及PCR循环的条件。 （1）未出现扩增条带可能的原因有：模板DNA含有杂蛋白或Tag DNA聚合酶的抑制剂（如蛋白酶K、苯酚、EDTA）；Tag DNA聚合酶失活；引物出现质量问题，浓度不合适；Mg2*浓度过低；变性温度低，变性时间短；目的序列变异；等等。 （2）出现非特异性扩增条带可能的原因有：模板DNA出现污染；Iag DNA聚合酶出现质量问题；引物特异性不强（如与非目的序列有同源性）或形成引物二聚体；Mg*浓度过高；退火温度（复性时的温度）过低；PCR循环次数过多；等等。 S z L w h S z L w h S z L w h S z L w h S z L w h S z L w h S z L w h S z L w h S z L w h S z L w h 关于PCR 一、PCR 二、RT-PCR 三、荧光定量PCR 四、重叠延申PCR 五、巢式PCR ... 实现定点诱变、鉴定...... 一、PCR 易错提醒