2024年高中生物竞赛课件 第四章 基因工程主要技术及原理1核酸提取、电泳、分子杂交（tk）

第四章 基因工程主要技术及原理 相关连接 内容概要 教学内容 重点提示 思考题 首 页 《基因工程》之 本节课主要涉及基因操作过程中常用的实验方法： DNA和RNA的提取与纯化 电泳技术 分子杂交技术 相关连接 内容概要 教学内容 重点提示 思考题 首 页 第一节 DNA和RNA的提取与纯化 破碎细胞或包膜－内容物释放 材料准备 核酸分离、纯化 沉淀或吸附核酸，并去除杂质 核酸溶解在适量缓冲液或水中 教学内容 20－60bp 一、基因组DNA的提取与纯化 DNA溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂 DNA钠盐比游离态更易溶于水 DNP在0.14mol/LNaCl中的溶解度是水中的1% DNP在1mol/LNaCl中的溶解度是水中的2倍 教学内容 4 生物材料的准备 新鲜，或者冻存的样品 液氮中研磨 加缓冲液 EDTA螯合Mg2+、Ca2+ SDS变性蛋白质 β-巯基乙醇、DTT打开二硫键和抗氧化 PVP与酚和多糖结合及抗氧化 裂解细胞 除杂 加CTAB或SDS结合多糖和蛋白 加酚仿去蛋白 纯化与保存 加乙醇或异丙醇沉淀 加乙醇反洗涤 吹干 水或TE溶解－20℃保存 教学内容 PVP：聚乙烯吡咯烷酮 NVP：乙烯基吡咯烷酮 基因组DNA的提取 --- 酚抽提法 样品的准备 细胞的裂解 蛋白质变性 DNA的抽提 DNA的沉淀 教学内容 血基因组DNA试剂盒 酵母基因组DNA试剂盒 细菌基因组DNA试剂盒 细胞基因组DNA试剂盒 教学内容 　CTAB法 流程图 植物材料 裂解液 上层溶液 液氮研磨 抽提 细胞裂解 干燥溶解 离心洗涤 酒精沉淀 DNA溶液 教学内容 CTAB( hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵 ) 8 SDS法 流程图 （以动物组织为例） 动物组织 细胞裂解 上层溶液 组织匀浆 抽提 干燥溶解 离心洗涤 酒精沉淀 DNA溶液 教学内容 　　　　　　 　 　　　　 　 　　　　　　　 利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离 有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用 利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物 　浓盐法： 　有机溶剂抽提法： 　密度梯度离心法： 教学内容 10 核酸分离、纯化策略 蛋白质的去除： 酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理 教学内容 11 多糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。 教学内容 多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合 核酸分离、纯化策略 盐离子的去除： 70％的乙醇洗涤 教学内容 13 CTAB溶液配制好备用，65℃水浴预热。猕猴桃叶片或果实采取后最好立即放到液氮中, 避免酚类物质氧化 65℃水浴一个小时 氯仿:乙醇:异戊醇=80:16:4的抽提液 两次。10000转/分离心20分钟，尽量把丝状物压紧，避免吸取上清时有丝状物牵拉 等体积预冷的异丙醇 ，75%乙醇洗去其他杂质。洗两次 。 用无水乙醇5毫升洗一次。晾干5分钟挥发掉乙醇后加入3-5mL的TE溶解，加入5uL, 1mg/mL的RNA酶后保存 猕猴桃DNA提取实例 　CTAB提取缓冲液的改进配方 组份 Tris-HCl （pH8.0） 　EDTA （pH8.0） NaCl CTAB PVP40 β-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 1.4M 3%(W/V) 5%(W/V) 2%（V/V）使用前加入 教学内容 猕猴桃基因组DNA 教学内容 闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快； 原理 二、碱裂解法提取质粒DNA DNA双链 变性 DNA单链 复性 强碱 中性 教学内容 染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起；当K+取代Na+时,生成不溶的PDS， 这些复合物从溶液中沉淀下来。 变性 教学内容 利用宿主菌线状染色体DNA与闭环双链质粒DNA的结构状态的差异来提取质粒D