第十五章  高效液相色谱法（课件）- 《药用化学基础（分析化学）》同步教学（劳保版·2023）

第十五章  高效液相色谱法 高效液相色谱仪 高效液相色谱法概述 01 02 03 04 目录 高效液相色谱法的定性、定量分析 高效液相色谱法的应用 2008年，三聚氰胺超标事件是一起食品安全事故。事故起因是很多食用三鹿集团生产的奶粉的婴儿被发现患有肾结石，随后在其奶粉中发现化工原料三聚氰胺。在三鹿婴幼儿奶粉事件发生后，国家批准发布了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》国家标准，标准规定了高效液相色谱法、气相色谱—质谱联用法、液相色谱—质谱／质谱法三种方法为三聚氰胺的检测方法。 学习导学 什么是高效液相色谱法？ 它与气相色谱法有何区别？ 它在食品、药品、工业分析中有什么作用呢？ 学习导学 §15-1 高效液相色谱法概述 学习目标 1.掌握高效液相色谱法的特点。 2.熟悉高效液相色谱法流动相的要求以及预处理的方法。 3.了解高效液相色谱法的原理。 高效液相色谱法(HPLC)又称为高压液相色谱法或高速液相色谱法，是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。 高效液相色谱法在药品研发、生产、质量控制、监督等领域中有广泛的应用。 一、高效液相色谱法的原理 1.原理 用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱。注入的供试品由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，对供试品进行分离测定。 一、高效液相色谱法的原理 2.固定相 高效液相色谱法使用最多的是化学键合相色谱法。 （1）键合相种类 非极性键合相:C18、C8、C1、ODS 弱极性键合固定相:醚基和二羟基键合相 极性键合相:氨基、氰基键合相 一、高效液相色谱法的原理 （2）键合相特点 化学稳定性好，使用过程中不流失；均一性和重现性好；柱效高，分离选择性好；适于梯度洗脱；载样量大。 （3）注意事项 流动相中水相的pH值2～8。 一、高效液相色谱法的原理 3.流动相 （1）HPLC对流动相的基本要求 不与固定相发生化学反应; 对试样有适宜的溶解度; 与检测器相适应; 纯度要高，黏度要小; 微孔滤膜过滤，脱气。 一、高效液相色谱法的原理 3.流动相 （2）流动相的极性和强度 反相色谱系统：甲醇—水、乙腈—水， 流动相极性越强，洗脱能力越强。 正相色谱系统：二氯甲烷—正己烷， 流动相极性越强，洗脱能力越低。 一、高效液相色谱法的原理 3.流动相 （3）流动相的预处理 用符合液相色谱纯度要求的试剂配制流动相； 使用前经微孔滤膜（0.45μｍ或0.22μｍ）过滤； 流动相使用前必须脱气； 储存于玻璃、聚四氟乙烯等容器内。 二、高效液相色谱法的特点及分类 1. 特点 分离效能高、选择性好、分析速度快、检测灵敏度高、自动化程度高。 （1）应用范围广。 （2）流动相选择性高。 （3）室温条件下操作。 二、高效液相色谱法的特点及分类 2. 分类 （1）液固吸附色谱法 （2）液液分配色谱法 （3）离子交换色谱法 （4）离子对色谱法 （5）分子排阻色谱法 §15-2 高效液相色谱仪 学习目标 1. 熟悉高效液相色谱仪的分析依据和工作流程。 2. 掌握高效液相色谱仪的组成、主要部件的名称与作用。 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。 高效液相色谱仪主要包括高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统。 一、高效液相色谱仪的组成 一、高效液相色谱仪的组成 １.高压输液系统 （１）高压输液泵 用于完成流动相的输送任务， 可分为恒压泵和恒流泵， 多用恒流泵中的柱塞往复泵。 高压输液泵 一、高效液相色谱仪的组成 （２）梯度洗脱装置 等强度洗脱：同一个分析周期内流动相组成保持恒定。 梯度洗脱：一个分析周期内以程序控制改变流动相的组成。 一、高效液相色谱仪的组成 2. 进样部分 安装在色谱柱的进口处，将试样引入色谱柱。 常用六通阀进样器和自动进样器。 自动进样器 一、高效液相色谱仪的组成 3. 分离系统 包括色谱柱、连接管、恒温器等。 色谱柱作用是分离，由柱管和固定相组成。 色谱柱 一、高效液相色谱仪的组成 4. 检测系统 紫外—可见分光检测器 （UVD） 荧光检测器 （FLD） 电化学检测器 （ECD） 示差折光检测器 （RID） UVD →色谱柱→样品在柱中分离→各组分依次进入检测器→显示器输出色谱图。 二、高效液相色谱仪的工作流程 流动相（储存于储液瓶中） 待测样品 1.准备工作：流动相，色谱柱，样品溶液，检查仪器。 2.开机、参数设定及平衡系统：接通电源，启动工作站软件，更换流动相