3.1基因工程中限制酶的选择课件2022-2023学年高二下学期生物人教版选择性必修3

基因工程中 限制酶的选择 娄底市第一中学 吴晨晖 1.定义 1970年,阿尔伯(W. Arber)、内森斯(D. Nathans),史密斯(H . C. Smith)在细菌中发现了第一个限制性内切酶(简称限制酶)后,20世纪70年代初相继发现了多种限制酶和连接酶,以及逆转录酶,这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。 2.来源 主要从原核生物中分离纯化出来的 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶,又称限制酶 3.作用特点 (1)能够专一性识别双链DNA分子的特定核苷酸序列; 一般由6个核苷酸组成,也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 (2)使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 EcoR I 限制酶 5´GAATTC3´ EcoR I (在G与A之间切割) Sma I (在G与C之间切割) 5' 5' 5' 5' 3' 3' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 黏性末端 平末端 4.作用结果 (1)黏性末端 限制酶在它识别序列的中心轴线两侧,将DNA分子的两条链分别切开时,产生的是粘性末端。 经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式,黏性末端和平末端。 5´AATT 3 ´ (2)平末端 限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时,产生的是平末端。 (1)不破坏目的基因原则:酶切位点位于目的基因的两端,应选择切点位于启动子、终止子之间的酶。如图甲中可选择PstⅠ,而不选择SmaⅠ。 5.图解限制酶的选择原则 注:图中限制酶的识别序列及切割形成的黏性末端均不相同。 A.NdeⅠ和BamHⅠ B.NdeⅠ和XbaⅠ C.XbaⅠ和BamHⅠ D.EcoRⅠ和KpnⅠ A 典型例题 1.如图为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的该基因与该质粒构建重组质粒,则扩增的该基因两端需分别引入哪两种限制酶的识别序列( ) (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则:质粒作为载体必须具备标记基因,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中不选择SmaⅠ。 2.图甲为构建重组质粒过程中的三种备选质粒,其中Ap为氨苄 青霉素抗性基因,Tc为四环素抗性基因。图乙为培育转AFPs基因(抗冻基 因)番茄的示意图,外源DNA和质粒上均标出了酶切位点及相关抗性基因,请回答下列问题。 (1)图甲中通常选用质粒C构建重组质粒,而不选用质粒A或质粒B的原因分别是_。 (2)据图乙分析,若需使用插入灭活法筛选并鉴定重组质粒,应优先选用限制酶_切割目的基因和质粒。 (3)通过PCR技术获取目的基因时需设计_种引物;从cDNA文库中获得的目的基因_(填“含有”或“不含有”)启动子和终止子。 质粒A中没有标记基因,质粒B的复制原点中含有Hind Ⅲ酶切位点 BamHⅠ和HindⅢ 2 不含有 质粒A中没有标记基因,质粒B的复制原点中含有Hind Ⅲ酶切位点 BamHⅠ和HindⅢ 2 不含有 (3)确保出现相同黏性末端原则:通常选择与切割目的基因相同的限制酶,如图甲中PstⅠ;为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 ①先用NdeI和XhoI酶切质粒2和空载体,将两种酶切产物连接获得连接产物。 ②用NcoI和MseI酶切质粒1,用Ncol和Ndel酶上一步中的连接产物,将两种酶切产物连接获得基因表达载体。 3.现需要构建同时含有mLDH、FDH的基因表达载体。 请你根据下图,提出将两个基因依次连入载体的思路_(要体现选用的内切酶和连接的先后顺序)。 (4)还要注意转录方向。 A.用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 B.用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 C.用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 D.用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 D 4.若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙) 构建重组DNA(见图丙),限制性内切核酸酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是 ( ) 巩固练习 1.从图1酶切结果分析,图2 中目的基因(长度为2.0kp)插入方向正确的重组质粒序号和作出该判断所用的限制酶是( ) A、①, BamHⅠ B、①,EcoRⅠ和HindⅢ C、②, EcoRⅠ D、②,EcoRⅠ和HindⅢ 1.3 4.5 2.3 3.5 B 2. 要在乳酸杆菌中表达W基因,需使用图1中的质粒为载体。图2为克隆得到的含W基因的DNA片段,W基因以乙链为转录模板链。 ①启动子往往具有物种特异性,在