备课素材：叶盘法的原理及影响因素-2022-2023学年高二下学期生物人教版选择性必修3

叶盘法的原理及影响因素 先看一道试题： 科学家利用叶盘法将葡萄的相关基因导入番茄，得到早熟番茄。 叶盘法的具体做法是：先将实验材料的叶子表面进行消毒，再用消 毒过的打孔器从叶子上取下圆形小片，即叶盘。将它放在土壤农杆 菌培养液中浸泡4~5mi,然后用滤纸吸干，放在特殊培养基上培 养两天后，转移到含有适当抗生素的选择培养基上继续培养。数周 后，叶盘周围会长出愈伤组织并分化成幼苗。请回答： (1)科学家培养早熟番茄应用了基因工程技术，该技术的原理是 科学家利用叶盘法时属于基因工程的第三步，即一。 (2)农杆菌通常感染 植物和裸子植物，是因为这些植物在伤 口处的细胞会分泌大量的化合物，吸引农杆菌。农杆菌能够介 导转化的原因是：一。 (3)愈伤组织经后续处理可以得到早熟番茄幼苗，这是因为愈伤组 织细胞中含有和」 答案 (1)基因重组将目的基因导入受体细胞 (2)双子叶酚类含有的T质粒上的T-DNA可转移至受体细胞， 并且整合到受体细胞染色体的DNA上 (3)番茄全套的遗传物质葡萄相关基因 解析： (1)基因工程技术的原理是基因重组。叶盘法是将葡萄的相关 基因导入番茄，是基因工程的第三步，即将目的因导入受体细胞。 (2)农杆菌通常感染双子叶植物和裸子植物，是因为这些植物在伤 口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌。农杆菌能够介 导转化的原因是含有的T质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并 且整合到受体细胞染色体的DNA上。 (3)愈伤组织经后续处理可以得到早熟番茄幼笛，这是因为愈伤组 织细胞中含有番茄全套的遗传物质和葡萄相关基因。 植物细胞利用农杆菌T质粒转化常用的方法称为叶盘法。叶盘 法实际上是对共培养法加以改进后而创立的一种转化方法。 那么，其原理是什么？影响因素有哪些？ 叶盘法的步骤： 先将实验材料（如烟草）的叶子表面进行消毒，再用消毒过的不 锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片，即叶盘。 在超净工作台上，为了对叶盘进行接种处理，需将它放在土壤 农癌杆菌培养液中浸泡4一5min,然后用滤纸吸干，放在看护培养 基上进行培养，注意需将叶子背面接触培养基。所谓看护培养基 是特定的固体培养基上均匀分布一层胡萝卜细胞或其他细胞的悬浮 液，然后覆盖一层滤纸即成。 叶盘在看护培养基上培养两天后，转移到含有适当抗生素的选 择培养基上进行培养。将经过共培养的外植体转移到加有选择压的 脱菌分化和愈伤组织诱导培养基上。在光照的条件下，25℃进行选 择培养。选择培养2一3周后，外植体的转化细胞捋分化出抗性不 定芽，或者产生抗性愈伤组织。将这些抗性材料转移到相应继代选 择培养基上，或者转入附加选择压的生长和分化培养基中，令其生 长和诱导分化。待不定芽长到1cm以上时，切下并插入含有选择压 的生根培养基上进行根培养，两周左右长出不定根。最后分化出幼 苗。 对这些幼苗的进一步检测（如用Southern印迹法、Northern 印迹法、免疫分析法等)可以确定它们是否含外源基因以及外源基 因的表达情况。 叶盘法的机理： 叶盘法实际上是对共培养法加以改进后而创立的一种转化方 法。用农杆菌感染叶片外植体并短期共培养。在培养过程中，农杆 菌的Vr基因被诱导，它的活化可以后动T-DNA向植物细胞的转移。 共培养后，也要进行转化的外植体的筛选、愈伤组织的培养、诱导 分化等步骤，以得到再生植株（如图）。 信号分子一 ① ⊙蛋白活化 ② Vir区 Ti质粒 装配 T-DNA 核定问 通道复合 成熟T复合体 农杆菌细胞 植物细胞 叶盘法的优点和影响因素： 叶盘法由于不需进行原生质体操作等，方法简单，获得转化植 株也更快，是用植物外植体为材料进行转基因的一个良好途径。影 响遗传转化因素也有很多，如植物基因型，农杆菌类型，外源基因 的选择、预培养和共培养时间等。 例、叶盘转化法是Horsch等人于1985年发展起来的一种转 化法，以培育转基因耐盐毛白杨为例，操作程序是先将毛白杨叶子 表面进行消毒，再用消毒过的打孔器从叶子上取下圆形小片，即叶 盘。然后进行下列操作，请回答： (1)毛白杨叶盘与重组农杆菌共培养以进行遗传转化：农杆菌能够 介导转化的原因是一。 (2)脱分化和筛选培养：叶盘接种在含卡那霉素的培养基上，卡那 霉素的作用是一，作为运载体的T质粒应含有 基因，运载 体上的 是RNA聚合酶识别和结合的位点。 (③)获得抗性植株：叶盘周围长出愈伤组织后分别转移到诱导“生 芽”和“生根”的培养基中，此过程培养基中加入的植物激素主要是 0 (4)耐盐基因的检测与鉴定： ①分子水平：可采用 的方法来检测转基因毛白杨提取液中有无 相应的耐盐蛋白。 ②个体水平：请设计个体水平检测方案 答案 (1)含有的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受 体细胞染色体的DNA上 (2)筛选出