2023届高三生物一轮复习-与PCR技术应用相关的教学疑难点例析

与PCR技术应用相关的教学浅难点例析 PCR技术是生物学考试中的热点与难点。近年来，随着PCR技术的快速发展，除常规 PCR外，还衍生出了重叠延伸PCR、反向PCR、荧光定量PCR、巢式PCR、不对称PCR、 多重PCR等技术，不同的PCR技术有着不同的应用。下面选取教学中与PCR技术相关的 疑难点，并结合典型试题，探讨几种PCR技术的应用。 1.利用PCR技术获取目的基因 获取月的基因是基因工程操作的第一步。新版高中生物学教材介绍了化学合成、借助载 体建立基因文库和通过PCR扩增DNA三种获取目的基因的方法。由于PCR是体外的DNA 扩增技术，部分学生在学习时，对如何利用PCR技术获取目的基因存在疑问。 【例1】“X基因"是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷 贝X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1A所 示。经4轮循环后产物中有5种不同的DNA分子，如图1B所示，其中第⑤种DNA分子有 ()个。 引物1引物2 31 X基因 A B 图1目的基因及PCR产物 2.利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤。新版高中生物学 教材介绍了借助戟体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中 是否转入了目的基因。在实际操作中，PCR技术不仅可精准地鉴定受体细胞是否转入目的 基因，还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。 【例2】为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进 行PCR鉴定。图3中A所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR 鉴定时应选择的一对引物是。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩 增出了400bp片段，原因是 图3重组质粒 3,利用PCR技术引导基因定点突变 随若PCR技术的不断创新，在实验中，可利用重叠延伸PCR技术引导基因定点突变， 重叠延伸PCR技术是如何将两个不同来源的DNA片段拼接的，也是学生普遍关心的问题。 下面结合例题进行分析。 【例3】水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR 技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺（密码子为 AAC、AAU)替换为赖氨酸（密码子为AAA、AAG》,从而提高水蛭素的抗凝血活性，原 理如图4所示。 第 3判物4 5 使用引物12 5 引物1 进行CR 用物3和4 进行PC程 第 混合、变性后，杂交 3 首先使用D聚合延伸 ·然后使用引物1和4进行PCH 图4PCR定点突变示意图 (1)若拟突变位点的碱基对为AT,则需要让其突变为才能达到目的。引物2 的突变位点（突起处）应设计为 (假设引物为单链DNA)。 (2)在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系 统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生 种DNA分子。 该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为 (3)利用重叠延仲PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利 用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2,基因N的引物N1、N2。 在设计这4种引物时，特别要注意的问画是 4.利用PCR技术扩增未知基因序列 应用PCR技术进行基因书扩增时，为了便于设计引物，要求目的基因两侧的序列是己知 的。如果未知序列的内侧是己知序列，可否利用PCR技术扩增外侧的未知基因序列呢？下 面结合例题进行分析。 【例4】如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR方法，简捷地分析出己知序列两侧 的序列，具体流程如图5（以EcoR I酶切为例）。 染色体DNA 【南切 CTTAAG 泥合的DNA片段 表知列列 已知序列醒未知序列 片段E Ⅱ连接】DNA连接 已知字列 PCRI物 环状DNA EcoR I Ⅲ扩增↓Tag DNA聚合酶 PCR饰物 V则序、分析 5 3”片段F的 完整字列 图5反向PCR示意图 请据图5回答问题。 (1)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤选用的引物必须 (从表2引物①②③④中选择，填编号)。 名称 DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列） 已知 5'-AACTATGCGCTCATGA-....GCAATGCGTAGCCTCT-3' 序列 5'-TTGATACGCGAGTACT-.---CGTTACGCATCGGAGA-3' D5'-AACTATGCGCTCATGA-3' 25'-GCAATGCGTAGCCTCT-3' 引物 35-AGAGGCTACGCATTGC-3' 5-TCATGAGCGCATAGTT-3 表2DNA序列 (2)对产物测序，