3.2 基因工程的基本操作程序（第三课时）-【生物优课PPT】2023-2024学年高中生物选择性必修3同步PPT课件

第三章|第二节 DNA片段的扩增及电泳鉴定 第三课时 目 录 CONTENT DNA片段的扩增及电泳鉴定 01 本章小结及练习 02 实 验 DNA片段的 扩增及电泳鉴定 第三章第二节 DNA片段的扩增及电泳鉴定 （1）PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。 变性 90˚C 延伸 72˚C 退火 50˚C 1. 利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理： （2）PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。一次PCR一般要经历30次循环。 （一）实验原理 DNA片段的扩增及电泳鉴定 （1）DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 2. DNA片段电泳鉴定的原理： （2）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象（迁移速率与之呈负相关）等有关。 （3）凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 （二）材料用具 1. 试剂： （1）无菌水、琼脂糖 （2）电泳缓冲液（TAE或TBE） （3）凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝） （4）核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭） （5）PCR反应体系的配方 DNA片段的扩增及电泳鉴定 （二）材料用具 1. 试剂： 材料 用量 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL DNA片段的扩增及电泳鉴定 （二）材料用具 2. 用具： （1）PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）； （2）微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）； （3）微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）； （4）一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）； （5）电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等） DNA片段的扩增及电泳鉴定 （二）材料用具 2. 用具： DNA片段的扩增及电泳鉴定 （三）方法步骤 移液 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 离心 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） 反应 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 1. DNA片段的扩增： DNA片段的扩增及电泳鉴定 （三）方法步骤 1. DNA片段的扩增： 可根据目的片段长度适当调整延伸时间 预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min DNA片段的扩增及电泳鉴定 配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀 制备 凝胶 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 DNA片段的扩增及电泳鉴定 加样 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物 电泳 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 观察 记录 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 DNA片段的扩增及电泳鉴定 （四）注意 1. 为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2. 该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3. 在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4. 在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 5. PCR扩增不能随