备课素材：大肠杆菌发酵表达及代谢调控-2022——2023学年高二下学期生物人教版选择性必修三

大肠杆菌发酵表达及代谢调控 2019版高中生物学选择性必修三说，大肠杆菌广泛应用于基因 工程的受体细胞： 在获得转基因产品的过程中，还可以通过构建基因文 库来获取目的基因，并且由于不同转基因产品所需要的目 的基因不同。受体细胞又有植物、动物、微生物之分，因 此基因表达载体的构建方法不是千篇一律的，将目的基因 导人受体细胞的方法也不是完全相同的。例如，将目的基 因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射直接 将目的基因注人动物的受精卵中（图3-8），这个受精卵将 发育成为具有新性状的动物。在基因工程操作中，常用 核生物作为受体细胞。中印以大肠杆应用最为 习研究人员一般先用C处理大肠杆菌细胞，使细胞 处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然 后再将重组的基因表达载体导人其中。 目前。基因工程已经步人产业化发展阶段，具有巨 大的生产力和发展潜力。我们在充满信心和期待的同时 ▲周3-多研究人员正在进行显圆 还要严格规范操作流程，科学、客观地评估风险，只有 注时操作 这样，才能让基因工程水葆生机。 之后，再用大肠杆菌发酵获取产品。 大肠杆菌及其衍生菌株是目前蛋白表达使用最广泛的菌株。与其 他革兰阴性菌一样，大肠杆菌有细胞内膜与细胞外膜之分，并将细胞 分成两部分空间，即细胞质与细胞周质，通常大肠杆菌表达的重组蛋 白存在于细胞质。细胞质内可溶性重组蛋白易受大肠杆菌内源性蛋白 酶降解，导致表达水平低下。形成包涵体的重组蛋白可有效避免内源 性蛋白酶的降解，且分离纯化方便，分离效率高，但重组蛋白的复性 较困难。 大肠杆菌的工业化发酵主要采用营养源诱导、温度诱导、IPTG (丙基硫代半乳糖苷和乳糖诱导3种方式： 1.营养源诱导 营养源诱导启动子包括phoA、ugp、mgl及araB等，此种表达方 式受培养基中的营养物质无机磷浓度(P)、糖原或生物素调控，其 他尚有H及溶氧诱导调控型，虽然其中一些表达系统的应用例子还 不多，但已显示出很好的发展潜力。 2.温敏性启动子诱导 温敏性启动子有PL、PR或其杂合启动子PLPR等。发酵培养温 度采用温度传感器检测并闭环控制，对于采用温敏型启动子的大肠杆 菌重组菌，温度检测与控制十分关键。在发酵过程中温度陡然升高， 使细胞内的酶活性加强，代谢加快，但当温度持续较高时，会引起细 胞内一些酶活性降低或变性，细胞活力逐渐减弱，甚至死亡，即产生 细胞内结构性变化。因此采用温敏型启动子菌株表达外源蛋白，诱导 时间较短，适用于培养规模较小的重组蛋白发酵。温度控制策略通常 以30℃或37℃开始培养大肠杆菌到所需的细胞密度，再升温至42℃ 进行诱导培养。对于温敏型表达系统，最佳的发酵过程控制方法是在 42℃高温诱导培养1h后，采用温度逐渐下降的变温策略，诱导时间 可明显延长，表达水平明显提高。 3.IPTG及乳糖诱导 采用IPTG诱导发酵的重组菌，IPTG浓度应控制在亚适量水平， 浓度过高导致细胞中毒，浓度过低引起启动子启动程度减弱，从而影 响外源蛋白高效表达。另外IPTG存在于发酵液中时，对蛋白纯化亦 带来一定难度。由于IPTG对细胞有一定的毒害作用、大规模发酵价 格昂贵和蛋白质药物纯化操作难度增加等原因，在实际大规模发酵 时，一般均采用乳糖替代IPTG。乳糖与其他碳源比例是关键因素， 乳糖浓度过小，由于甘油等碳源对启动子产生阻遏作用或抑制作用， 使启动子不能启动或启动强度不够易造成不表达或低水平表达，而乳 糖浓度过大，会使得菌体只利用乳糖，造成碳源浪费，一般乳糖浓度 约为2g/L。 大肠杆菌培养过程中，特别是菌和宿主菌的生长速率、底物消耗 速率、产物生成速率、质粒稳定性等动力学规律，是大肠杆菌发酵过 程优化的重要基础。通过分批培养、补料分批培养和连续培养进行有 关动力学研究，对制定的优化控制策略加以验证和调整改进大肠杆菌 的代谢活动，可利用一些宏观变量观察和跟踪。虽然细胞水平代谢活 动是肉眼无法直接观察的，但pH、溶氧、氧消耗速率、二氧化碳释 放速率、呼吸商、菌体细胞生长、糖耗、氨耗等宏观变量的变化提供 了代谢活动的线索，反映了菌代谢流的状况，是发酵工艺控制和干预 依据，也是发酵过程放大的重要依据。配置多种传感器，利用计算 机采集数据并控制的发酵罐是进行有关研究的关键手段。大肠杆菌表 达系统（宿主菌、外源基因、载体等）不同时，发酵培养表现的代谢 过程特征也不同。有些可通过发酵过程的操作优化（补料策略环境条 件优化等) 使细胞代谢正常，获得高效表达：有些可能是基因背景 原因无法实现高效表达。 1.宿主菌的选择 不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在很大差 别。现在普遍应用的大肠杆菌BL21(DE3)plysS因其带有编码T7溶菌 酶的小质粒，而有效地降低杂蛋白的表达，但不影响IPTG诱导目的 蛋白