基因工程技术拓展 2022—2023学年高二下学期生物人教版选择性必修3

一.高通量测序技术（第一代） 第一代测序技术以桑格-库森法为代表。桑格-库森法又叫作双脱氧法，它以DNA合成反应为基础。桑格-库森法测定DNA序列的原理如图所示。首先，在每个反应体系中加入同位素标记的引物，待测的DNA片段，足够量的脱氧核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)和DNA聚。然后，在四个反应体系中分别加人少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddGT、ddCTP和ddTTP)进行PCR反应。以加入ddATP的反应体系为例，每次合成反应如果配对的为ddATP，反应就会停止，如果为dATP，反应可以继续，直到与ddATP配对反应才会停止，所以在该反应体系中我们会得到长短不一的，以ddA结尾的片段。再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离四个反应体系中的产物并进行放射自显影，得到图谱后就可以读取核苷酸的排列顺序了。 二、逆转录PCR 逆转录PCR(reverse transcription PCR，简称RT-PCR)，是从mRNA获得cDNA(互补DNA）并进行扩增的一种实验技术。进行逆转录PCR时，通常要先提取总RNA;然后以其中的mRNA为模板，利用oligo(dT)(寡脱氧胸腺苷酸)或随机引物在逆转录酶的作用下合成cDNA;再以cDNA为模板进行常规的PCR扩增。oligo(dT)是由个数少于20的脱氧胸腺苷酸连接而成核苷酸链，它可以特异性地结合到mRNA的多腺苷酸尾巴(多A尾)，从而将mRNA从总RNA分离出来。 三.实时PCR 实时聚合酶链反应简称实时PCR(real-time PCR)，它是一种定量测定样品中特定DNA片段的聚合酶链反应。反应中一般使用带有荧光标记的PCR引物，从而能够通过荧光监测每次PCR循环后扩增所得的产物的量。通过连续监测获得的反应动力学曲线，可推导出样品中模板DNA的初始含量。 由于实时PCR可以对初始模板DNA进行定量分析，因此该技术在科研工作中应用广泛。例如，可以用该技术测定相同基因在不同组织中的表达量，或测定同一组织中不同基因的表达量。进而进行对比、分析。以对比A基因在拟南芥根和叶中的表达情况为例，可以先分别提取拟南芥根和叶的RNA;然后将其逆转录为cDNA;再以cDNA为模板来进行实时PCR;最后基于PCR的结果就可以对A基因在拟南芥根和叶中的表达情况进行分析。 四.目的基因是否导入受体细胞的检测 检测目的基因是否导入受体细胞的方法主要有以下几种 1.载体表型选择法 基因工程中使用的载体往往会携带选择性标记，最常见的是携带一个或多个抗生素的抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因等。受体细胞本身对某种抗生素是敏感的，在含有该抗生素的培养基上无法生长;当携带该抗生素抗性基因的载体转人受体细胞后，受体细胞可以在含有该抗生素的培养基上生长。利用这个原理可以达到筛选的目的。需要注意的是，这种方法只能检测载体是否成功转入，转人的载体中可能有自身环化的载体，所以要确定目的基因是否真的转人，还必须借助其他筛选方法。 B-半乳糖苷酶显色反应选择法，即我们常说的蓝白斑筛选法，也是一种常用的检测目的基因是否导入受体细胞的方法。这种检测方法用到的载体上有LacZ基因，其表达产物为无活性的α肽段。受体细胞可以合成无活性的ω肽段。α肽段与ω肽段结合后可以产生有活性的 β-半乳糖苷酶，该酶能将无色的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)水解成蓝色产物。如果目的基因插入LacZ基因的多克隆位点，重组载体转入受体细胞后就不能产生β-半乳糖苷酶、X-gal也就无法水解成蓝色产物，因此在筛选平板上含有重组载体的菌落呈白色。 2.DNA电泳检测法 DNA电泳检测法是基因工程中常用的检测目的基因是否导人受体细胞的方法。可以提取体细胞中的质粒直接进行电泳检测，但含有目的基因的重组质粒一般比较大，在电泳凝胶中的移速率较慢、为了增加实验的准确度，可以选择合适的限制酶对质粒进行切割后再进行电泳检测，同时可借助指示分子大小的标准参照物来进一步鉴别目的基因。除此之外，还可以以质粒为模板进行PCR扩增，之后再进行电泳检测。设计PCR的一对引物时，最好一个引物与质粒DNA互补结合，另一个引物与目的基因DNA互补结合，这样只有以重组DNA为模板才能获得扩增产物，从而进一步增加了实验的可信度。DNA电泳检测法可以与前面介绍的载体表型选择法相结合，来快速、准确地检测目的基因是否导人受体细胞。 3.核酸杂交检测法 DNA印迹法是核酸杂交检测法中的一种，用于对DNA分子的检测。用这种方法检测目的基因是否导人受体细胞的基本过程是:首先提取受体细胞的DNA，用限制酶切割DNA分子后，进行琼脂糖凝胶电泳;然后对分离后定位在凝胶上的不同分子量的DNA进行碱变性处理，并将凝胶中变性的DNA转移至硝酸纤维