3.2基因工程的基本操作程序课件-2022-2023学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

基因工程 的基本操作流程 第 2 节 第三章 基因工程 用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因 主要指编码蛋白质的基因 Bt基因 Bt抗虫蛋白 编码 eg 苏云金杆菌 含有 (二)筛选目的基因 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 (一)目的基因 一、目的基因的筛选与获取 1.人工合成 2.利用PCR获取和扩增目的基因（常用） 3.从基因文库中获取 一、目的基因的筛选与获取 (三)获取目的基因的方法 1.人工合成 在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家采用的是人工合成的方法。 DNA合成仪 转基因抗虫棉 在已知目的基因核苷酸序列且基因较小的情况下，利用DNA合成仪自动合成。 2.利用PCR获取和扩增目的基因 (1)原理： 半保留复制 (2)条件： 解旋酶 或高温 ⑥缓冲液 ②DNA模板 ⑤2种引物 ③4种脱氧核苷酸 ④耐高温的DNA聚合酶 ①解旋酶或高温 ⑤2种引物 短单链核酸(DNA或RNA)　　　　 本质： 作用： 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸　　　　 引物连接模板链的3’端　　　　 游离的脱氧核苷酸连接在引物的3’端　　　　 注意：1种引物会导致引物与引物之间结合形成双链，不能与模板链结合。 耐高温的DNA聚合酶 4种脱氧核苷酸 引物 待扩增的DNA片段 3’ 3’ (3)PCR扩增过程 变性 温度超过到90℃以上，双链DNA解旋为单链 复性 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 延伸 当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 (4)PCR小结 ①过程： 变性 目的基因DNA受热变性后解为单链 复性 2种引物与单链相应互补序列结合 延伸 以DNA单链为模板，在耐高温的DNA聚合酶作用下延伸。即将4种脱氧核苷酸加到引物的 3’端 1个模板DNA分子经过n轮PCR，以指数形式扩增，可以扩增出约2n个DNA片段。　　　　 ②结果： (超过90℃) (50℃左右) (72℃左右) 第 一 次 循 环 90℃以上，DNA双链解开 50℃左右，引物与DNA结合 72℃左右，新DNA合成 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 第 二次 循 环 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 高温变性、 中温延伸 低温复性、 第 三次 循 环 3’ 5’ 高温变性 中温延伸 低温复性 ③PCR技术获取目的基因时至少要经过3次循环才能从DNA分子中分离出目的基因 ④经过n轮复制，需要引物 个 (4)PCR小结 第 一 次 循 环 90℃以上，DNA双链解开 50℃左右，引物与DNA结合 72℃左右，新DNA合成 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 第 二次 循 环 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 高温变性、 中温延伸 低温复性、 第 三次 循 环 3’ 5’ 高温变性 中温延伸 低温复性 ③PCR技术获取目的基因时至少要经过3次循环才能从DNA分子中分离出目的基因 ④经过n轮复制，需要引物 个 只有两条母链上没有引物 ⑦常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR产物 2n+1-2 ⑤引物不能重复利用 ⑥PCR过程是先解旋，后复制 (4)PCR小结 (5)PCR技术与生物体内DNA复制的比较 《导学案》P107 3.从基因文库中获取 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 种类 基因组文库： 部分基因文库： 含有一种生物所有基因的受体菌群 只含有一种生物部分基因的受体菌群 ( eg cDNA文库) 利用mRNA逆转录形成的DNA片段 二、基因表达载体的构建 1.作用 (1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。 (2) 同时使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成 ——核心步骤 目的基因 标记基因 启动子 终止子 复制原点 (2)标记基因：将含有目的基因的细胞筛选出来 (1)目的基因：主要指编码蛋白质的基因 2.组成 必须插入到启动子和终止子之间 eg四环素抗性基因、荧光蛋白基因等 非编码区 编码区 非编码区 启动子 终止子 转录 成熟mRNA RNA聚合酶识别和结合位点 结束转录 原核生物基因的结构 开启转录 非编码区 编码区 非编码区 转录 前体mRNA 外显子 内含子 剪切 拼接 成熟mRNA 外显子：编码区编码蛋白质的序列 内含子：编码区不编码蛋白质的序列 真核生物基因的结构 启动子 终止子 (2)标记基因：将含有目的基因的细胞筛选出来