备课素材：DNA连接酶的种类和作用机制-2022-2023学年高二下学期生物人教版选择性必修3

DNA连接酶的种类和作用机制 2019版高中生物学选择性必修三“基因工程”介绍了常见的两种DNA连接酶： DNA连接酶的作用是连接磷酸二酯键,将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。根据酶的来源不同，可以将这些酶分为两类:一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为EcoilDNA连接酶:另一类是从T4噬菌体中分离出来的，称为T4DNA连接酶。”课本中虽然介绍了DNA连接酶的发现时间、酶的来源及不同DNA连接酶所起的作用，并提出“连接平末端之间的效率比较低”，但其中还有很多的信息没有提供，如连接酶是如何起到连接作用的，对哪些DNA分子起作用都没有介绍，而目前高中阶段生物学试题很多是以已知信息的形式提供给学生，当学生对某些知识不了解的时候很难提取信息并分析问题。这些情况可能会对教学以及学生的理解带来一定的困难。 1．DNA连接酶的发现 DNA连接酶最早于1967年由三个实验室同时发现，经过科学家几十年的研究发现，目前在病毒、细菌和真核生物体内都发现了DNA连接酶，不同类型的DNA连接酶的作用机制不同。 一般情况下，根据DNA连接酶催化反应所需的能量来源可以把DNA连接酶分为腺苷三磷酸(ATP)依赖型和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖型,腺苷三磷酸依赖型DNA连接酶广泛存在于真核生物、古细菌、真细菌和病毒中,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖型DNA连接酶则分布在古细菌、直细菌和病毒中。 最近研究发现，不同类型的DNA连接酶在系统演化上具有一定的联系，所以研究DNA连接酶，不仅可以帮助我们了解DNA连接酶在DNA复制、重组和修复中的作用机制，同时也可以帮助我们研究物种的分布特点和系统演化规律。 2． DNA连接酶的常见种类和作用机制 2.1 腺苷三磷酸(ATP)依赖型 2.1.1 TDNA连接酶 T4DNA连接酶是目前应用比较多的病毒基因组编码的4DNA连接酶，在基因重组中广泛使用。噬菌体类型较多，目前研究发现T4噬菌体能够合成T4DNA连接酶，并且已经能够从被T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取该酶，此外科学家也已经定位该酶的合成基因，即噬菌体T4的30基因。 T4DNA连接酶具有连接黏性末端和平末端的作用，研究发现当以切口DNA、黏性末端和平末端DNA为底物时，TDNA连接酶对切口DNA的亲和力最大，而黏性末端DNA的亲和力则大于平末端DNA一般情况下TDNA连接酶对平末端的连接效率很低。 在科学研究中，为了提高连接平末端的效率，一般对平末端进行酶切形成黏性末端再进行连接。经过不同科学家的研究，目前对DNA连接反应的基本机理有基本一致的观点，即都是通过把双链DNA分子切割后，暴露出切口，然后进行连接。研究人员总结DNA片段的连接过程，认为整个DNA连接反应可以通过三个连续步骤来完成: (1)ATP通过断裂最后一个高能磷酸键释放能量，同时产生的AMP和T4DNA连接酶利用ATP水解释放的能量形成E-AMP复合物; (2)所形成的E-AMP复合物可以识别DNA双链之前被切开的切口，识别之后AMP会脱离E-AMP复合物并与DNA的5’-P基团结合; (3)需要连接的另外一段DNA分子片段的3’-0H会攻击第二步形成5’-P-AMP，3’-OH和磷酸基团残基发生反应形成磷酸二酯键，同时释放出一个AMP 2.1.2 真核生物 DNA连接酶 真核生物存在3种ATP依赖型DNA连接酶--DNA连接酶I、DNA连接酶Ⅲ和DNA连接酶Ⅳ。 研究显示，DNA连接酶I和DNA连接酶Ⅳ广泛分布于真核生物中，如植物界和动物界，DNA连接酶Ⅲ则主要分布于脊椎动物中。 目前科学家认为，在真核生物DNA复制过程中，起到连接作用的可能主要是DNA连接酶I，DNA连接酶I活性的调节与其氨基端有关，在其氨基端靠近活性中心有一个特定的部位，该部位可以通过磷酸化作用来调节DNA连接酶I的活性。DNA连接酶I的作用就是将DNA复制时复制叉处形成的不连续的后随链(冈崎片段)连接起来。 在此过程中DNA连接酶I并不是单独起作用，而是需要和多种蛋白因子密切合作共同完成。在真核生物DNA复制时，后随链是由DNA聚合酶α催化合成的，DNA聚合酶Q先催化合成一段引物，然后依赖DNA聚合酶与增殖细胞核抗原(持续复制因子)，从引物开始合成DNA,然后引物通过降解出去。 此外，在损伤的 DNA的碱基修复中，DNA连接酶I也同样起到重要的作用。 首先细胞内的特异性的核酸内切酶和外切酶特异性识别损伤部位，在DNA单链损伤部位的附近进行剪切,切除一段DNA，然后DNA聚合酶以另一条完整的DNA链作为模版进行修复合成重新合成这段 DNA,最后由DNA连接酶I将缺口连接。 哺孚动物 DNA连接酶基因编码两种连接酶——连接酶Ⅲα和连接酶Ⅲ3，这两种酶的区别在C端。 DNA连接酶皿在核苷酸切