2023届高三二轮复习生物：PCR技术1-重叠PCR技术课件

科普课：重叠PCR技术 致敬：凯利·穆利斯 凯利·穆利斯（Kary Banks Mullis，1944年12月-2019年8月7日），美国著名化学家，因发明高效复制 DNA片段的“聚合酶链式反应（PCR）”方法而获得1993年诺贝尔化学奖。 一.PCR技术 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，体系中加入dNTP、Mg2+以及延伸因子、扩增增强因子，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。 DNA聚合酶： ①具有5’→3’聚合酶活性，这就决定了DNA只能沿着5’→3’方向合成； ②需要引物，DNA聚合酶不能催化DNA新链从头合成，只能催化dNTP加入核苷酸链的3'-OH末端。因而复制之初需要一段DNA引物的3’一OH端为起点，合成5’→3’方向的新链。 DNA 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 引物A 5’ 引物B 二.重叠PCR技术 1.重叠PCR技术的定义 重叠延伸PCR技术 (gene splicing by overlap extension PCR，SOE PCR)，是采用具有互补末端的引物，使 PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。 这项技术目前主要有两个应用方向：构建融合基因；基因定点突变。 引物A 引物B 设计：不同基因的引物互补序列 二.重叠PCR技术 2.重叠PCR技术的应用 （1）构建融合基因 将基因M和基因N链接起来的方法，我们可以用同尾酶切割，再用DNA链接酶将他们连在一起。但有时我们并不一定能够找到合适的酶切位点，或者说我们找到了酶切位点，但这种酶的特殊性（价格，保存），因此使用限制酶和DNA连接酶很难得到产物。 基因M 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 基因N 二.重叠PCR技术 2.重叠PCR技术的应用 （1）构建融合基因 重叠PCR技术可以将基因M和基因N链接起来。其过程为： 基因M 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 基因N 设计引物 PCR扩增两端 回收两端片段 两端片段退火延伸 扩增全长基因 二.重叠PCR技术 2.重叠PCR技术的应用 （1）构建融合基因 基因M 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 基因N 引物B 引物A 引物C 引物D ①设计引物 D’与引物D互补配对 A’与引物A互补配对 D’ A’ 二.重叠PCR技术 2.重叠PCR技术的应用 （1）构建融合基因 基因M 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 基因N 引物B 引物A 引物C 引物D ②PCR扩增两端 D’与引物D互补配对 A’与引物A互补配对 D’ A’ PCR只扩增两个引物之间的DNA片段，因此我们只分析其构建的两个引物（D’-A引物，A’-D引物）的与之结合的DNA链的复制。因为设计的这两个因为碱基互补配对，所以基因M,基因N要单独进行PCR扩增。 二.重叠PCR技术 2.重叠PCR技术的应用 （1）构建融合基因 基因M 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 基因N 引物B 引物A 引物C 引物D ②PCR扩增两端 D’与引物D互补配对 A’与引物A互补配对 D’ A’ 5’ 3’ A D’ 5’ 3’ D A’ PCR扩增第一次 二.重叠PCR技术 2.重叠PCR技术的应用 （1）构建融合基因 ②PCR扩增两端 D’与引物D互补配对 A’与引物A互补配对 5’ 3’ A D’ 5’ 3’ D A’ PCR扩增第二次 5’ 3’ A D’ 5’ 3’ D A’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 引物B A’ D 5’ 3’ 引物C 二.重叠PCR技术 2.重叠PCR技术的应用 （1）构建融合基因 ③回收两端片段 并进行④两端片段退火延伸 5’ 3’ A D’ 5’ 3’ D A’ 5’ 3’ 引物B A’ D 5’ 3’ 引物C 为了方便理解，我们把这4条链编上序号：1、2、3、4，退火后的结果为： A D’ 1 5’ 3’ 1 2 3 4 5’ 3’ 4 D A’ A D’ 引物C A D’ 3 5’ 3’ 5’ 引物B A’ 2 D 3’ 基因M和基因N重叠区域 二.重叠PCR技术 2.重叠PCR技术的应用 （1）构建融合基因 ⑤扩增全长基因 D A’ A D’ 1 5’ 3’ 5’ 3’ 4 引物C A D’ 3 5’ 3’ 5’ 引物B A’ 2 D 3’ DNA聚合酶：具有5’→3’聚合酶活性，这就决定了DNA只能沿着5’→3’方向合成； （ ） （ ） √ × 二.重叠PCR