备课素材：PCR 扩增技术的种类2022-2023学年高二下学期生物人教版选择性必修3

PCR 扩增技术的种类 2019版高中生物学选择性必修三介绍了PCR技术： 随着生物技术的飞速发展,曾经遥不可及的PCR技术走进了高中生物学。考题中有关PCR的问题越来越多,设问考查深度也明显提升。人教版教材中介绍的是常规PCR流程。高中生物学常考的PCR类试题却并不仅限于这种类型。 那么，PCR技术有哪些类型？ 1、常规PCR CR仪中通常要加入7种成分:模板 DNA片段引物、脱氧核苷酸底物、Taq酶、酶所需缓冲液、Mg2+和纯净水。 注意:一是引物的长度一般在16bp以上，以避免其与模板配对 时的非特异性结合。但引物越长，需要测定的模板DNA序列越多,制作引物的成本越高，所以18~30bp是较为理想的长度。二是引物中G+C的含量要尽量控制在40%~60%，这样可以保证较高的退火温度，3末端要尽量避免T(引物末尾碱基是T时错配的概率远大于其他3种)。三是缓冲液中需要添加Mg2+来激活Taq酶的活性中心。 常规PCR的相应例题较为普遍，在此不再赘列。 2、反向PCR 反向PCR多用于扩增的DNA分子中仅部分序列已知,其扩增的思路:先利用多种限制酶对待测DNA片段进行随机切割,再利用DNA连接酶对片段进行环化。随后在已知序列的两个末端设计引物,进而来扩增已知序列两侧的未知序列。 例1.反向PCR可利用一段已知DNA序列设计合理的引物,扩增已知序列两端的未知序列,如图1所示。图中已知序列一条链的碱基排列顺序为“5-AACTATGCGCTCATGA……-GCAATGCGTAGCCTCT-3”。下列叙述错误的是( ) A．I酶切:用一种限制酶切割 DNA,以使两端未知序列形成相同的黏性末端 B.Ⅱ连接:使用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键 C.设计的两种引物分别是“5-AACTATGCGCTCATGA-3”和“5-AGAGGCTACGCATTGC-3'” D.对PCR产物测序,经分析得到了片段F的完整序列，该DNA单链序列可能为“5-AATTCCAGT……-CTGAATT-3” 答案:C。两种引物需与已知序列发生互补配对,而后向两侧延伸合成未知序列。 反向PCR在基因序列鉴定过程中具有独到优势，但也存在一些限制条件:一是必须选择一种合话的限制酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。二是若使用的引物含有待测DNA的某些重复序列，反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。 3、多重PCR(MPCR) 多重PCR(MPCR)在高中生物学考题中出现的频率非常高,顾名思义就是在同一反应体系中使用一对以上的引物对同一DNA分子进行扩增，不同引物结合的位置不同，扩增的产物也有差异。通过比较扩增产物的大小差异即可判断样品中有哪些基因。 例2.随着科学技术的发展,MPCR技术在扩增方面取得新的突破,不再局限于在同一反应管中进行扩增,而是将不同的引物对和模板分散于相应独立的空间中进行扩增。下列相关叙述错误的是（ ） A.对于同一DNA片段的不同区段进行扩增时，不同引物的碱基排列顺序不能互补 B.同一反应体系中扩增不同模板时需加入更多TaqDNA聚合酶才能使扩增正常进行 C.在目的DNA片段扩增时,若复性阶段温度控制过高，可能导致无产物 D.PCR扩增DNA时打开双螺旋的方式与细胞内不同,实质都是磷酸二酯键断裂 答案:D。PCR扩增时打开的是DNA的氢键，与细胞内打开方式不同,但作用的化学键相同，D错误。 多重PCR最大的缺陷是由于扩增产物不同，扩增多次后形成二聚体和多聚体的概率逐步增大，导致非特异性扩增大幅上升。 4、巢式PCR 巢式PCR先用待扩增DNA外侧的一对引物完成一次PCR,再将其作为模板，根据原来引物内侧的序列设置新的引物，再次完成第二次PCR。由于第二次 PCR的模板 DNA片段更短,引物更小因此可以减少第一次扩增中出现的非特异性扩增片段,提升扩增的精确性。但由于操作过程中的开盖处理,会增加产物污染的概率。 例3.图2是巢式PCR工作原理示意图，请回答: (1)若用外引物扩增产生了错误片段,再用内引物在错误片段上进行引物配对并扩增的概率 ,因此，相较常规PCR获得的产物而言，巢式PCR获得产物特异性 。 (2)巢式PCR通常在一个试管中进行第一阶段反应,然后将中间产物等转移到第二试管中进行第二阶段反应，不在同一试管中进行的主要原因是 。 答案:(1)降低 更强 (2)防止内引物在第一阶段PCR中发挥作用，无法实现巢式PC