3.2.3实验：PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳课件2022-2023学年高二下学期生物人教版选择性必修3

目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 第一步 第二步 第三步 第四步 目的基因的检测与鉴定 前提 核心 关键 保证 利用PCR获取和扩增 目的基因、启动子、终止子、标记基因 农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、 感受态细胞转化法(微生物); 分子检测：是否插入、转录、翻译 个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。 温故知新：基因工程的基本程序 1 实验原理 材料用具 实验步骤 DNA体外扩增的原理 DNA片段电泳鉴定原理 实验探究：DNA片段的扩增及电泳鉴定 第四 步：目的基因的检测与鉴定 一、实验原理 （一）DNA体外扩增的原理： PCR仪 ①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。 ②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理； PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 一、实验原理 （二）DNA片段电泳鉴定原理： 电泳鉴定原理 DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 琼脂糖凝胶电泳 DNA分子电泳 二、材料用具 （一）仪器： PCR仪 微量离心管 电泳装置 微量移液器 自动控温，实现DNA的扩增 实际上是进行PCR反应的场所 用于向微量离心管转移PCR配方中的液体 包括电泳仪、电泳槽等 第三步：将目的基因导入受体细胞 二、材料用具 （二）试剂： （1）无菌水、琼脂糖； （2）电泳缓冲液（TAE或TBE）； （3）凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝）； （4）核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）。 （5）PCR反应体系的配方 材料 用量 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL 移液 离心 扩增 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min / / 可根据目的片段长度适当调整延伸时间 预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 三、PCR方法步骤 预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 可根据目的片段长度适当调整延伸时间 四、电泳方法步骤 配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀 制备凝胶 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 加样 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物 电泳 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 观察记录 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实验 注意事项 为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 PCR扩增不能随意加大试剂用量。 结果分析与评价 1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 2.你进