3.1重组DNA技术的基本工具第2课时课件2022-2023学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第1节 重组DNA技术的基本工具 （第二课时） 讲课人：涂梦婷 第三章 基因工程 复习——限制酶 限制酶 来源 特点 原核生物 特异性 只识别特定的核苷酸序列 只断开特定部位的磷酸二酯键 一般由6个核苷酸组成 （回文序列—中心对称、反向平行） 切割末端类型 黏性末端和平末端 复习——限制酶 ②能根据切出的片段说出限制酶的识别序列和位点 ···G ···CTGCA GACGTC ①找出限制酶的识别序列和切割部位/写出黏性末端 EcoRⅠ：— GAATTC — …TCCTAGAATTCTCGGTATGAAT… …AGGATCTTAAGAGCCATACTTA… TaqⅠ：— TCGA — 复习——限制酶 ③限制酶作用后产生的黏性末端、断裂的磷酸二酯键数等问题 限制酶作用一次： 断开_____个磷酸二酯键； 产生_____个游离的磷酸基团； 产生____个黏性末端； 消耗____分子水； 2 2 2 2 复习——限制酶 ④切割出的片段数量问题（如图最多产生多少不同长度的片段？） Ⅰ编号 Ⅱ从最小片段算起 a b c 复习——DNA连接酶 DNA连接酶 E.coli DNA连接酶 （形成磷酸二酯键） T4DNA连接酶 只缝合黏性末端 缝合黏性末端和平末端（效率低） 能碱基互补配对 DNA聚合酶 vs 以一条链为模板，将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键 复习——质粒 种类： 质粒、噬菌体和动植物病毒等。 条件 ①具有一个至多个酶切位点 【供外源DNA片段（基因）插入其中】 ②能在细胞中进行自我复制或者整合到受体DNA上 【使目的基因同步复制并能在受体细胞中稳定存在】 ③具有特殊的标记基因【便于重组DNA分子的筛选】 ④对受体细胞无毒害作用【不影响受体细胞的正常生命活动】 DNA的粗提取与鉴别 实验原理 8 DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。 DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精 DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液 在一定温度下（沸水浴），DNA被二苯胺试剂染成蓝色 初步分离DNA和蛋白质 溶解DNA 鉴定DNA 1.材料：新鲜洋葱（也可以选择香焦、菠菜、菜花和猪肝等作为实验材料，提取DNA的方法可能稍有不同）、研磨液、体积分数为95%的酒精、2 mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。 2.用具：烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。 实验用具 DNA的粗提取与鉴别 取材、研磨 过滤或离心取上清液 预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA NaCl溶液溶解DNA并鉴定 DNA的粗提取与鉴别 称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。 洋葱 研磨液 选取DNA含量相对较高的生物组织 能不能选择哺乳动物成熟的红细胞？ 取材、研磨 过滤或离心取上清液 预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA NaCl溶液溶解DNA并鉴定 DNA的粗提取与鉴别 称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。 洋葱 研磨液 选取DNA含量相对较高的生物组织 不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为它没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA 作用：溶解并提取DNA 研磨的目的：破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中 SDS：使蛋白质变性与DNA分离; EDTA：是一种DNA酶的抑制剂，可防止细胞破碎后 DNA酶降解DNA; Tris：提供缓冲体系，DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态。 NaCl：溶解DNA 研磨液可以用洗涤剂和食盐 取材、研磨 过滤或离心取上清液 预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA NaCl溶液溶解DNA并鉴定 DNA的粗提取与鉴别 称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。 洋葱 研磨液 在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置几分钟后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min下离心5min，取 。 上清液 上清液 不可以用滤纸代替，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。 取材、研磨 过滤或离心取上清液 预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA NaCl溶液溶解DNA并鉴定 DNA的粗提取与鉴别 称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。 洋葱 研磨液 在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置几分钟后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管