专题10 PCR引物设计-备战2023年高考生物重难点专题精讲课件

PCR引物设计 PCR引物设计 PCR的核心考点: 引物设计; 1.PCR引物设计：方向 引物序列和目的基因的关系？ 引物的5′端与模板链3′端互补配对（记得写方向） 针对训练 针对训练 在核酸分子杂交技术中,常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针。为了获得B链作探针(如图),可应用PCR技术进行扩增,应选择的引物种类是(　　) A.引物1与引物2 B.引物3与引物4 C.引物2与引物3 D.引物1与引物4 C 针对训练：扩增载体序列 拓展思考 如果进行逆转录，引物应该如何设计？ 1.PCR引物设计：位置 【答案】乙丙 目的基因反向连接 引物序列 限制酶 识别 序列 1.PCR引物设计：限制酶修饰 拓展思考 为什么限制酶识别序列一定要添加在引物的5’？ PCR扩增的时候，至少要几个循环才能出现目的基因等长度的扩增片段？ 如果要给目的基因添加启动子，应该如何设计引物？ 三轮PCR出真理 用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如下图所示，X为某限制酶识别序列。扩增得到的绝大部分DNA片段是图A-D中的（ ） D 针对训练 PCR过程中,如果用的是长模板，一般要经过几轮循环,才能得到完整的目的基因? 针对训练 绿-269-3T 1.PCR引物设计：保护碱基 思考-1：要正常表达出融合蛋白，还需要如何处理？ 答案：需要把中间的终止密码子对应的DNA序列删除掉。 思考2:为什么目的基因能和载体上的EGFP基因能连接在一起？ 答案：因为二者通过有限制酶切割后产生了相同的黏性末端。 思考3:经过DNA连接酶连接后，这段限制酶识别序列位于就位于目的基因和EGFP基因之间。 如果限制酶识别序列是SmaⅠ：CCC↓GGG。这段序列碱基个数是3的倍数，所以不会导致后续的EGFP基因转录的时候发生移码突变； 如果限制酶识别序列是Sau3AⅠ：↓GATC。。这段序列碱基个数不是3的倍数，就会导致后续的EGFP基因转录的时候发生移码突变； 思考4:如果Sau3A I，那后续EGFP基因的编码序列是移码突变的，会乱码。如何解决这个问题? 答案：需要在限制酶识别序列一端加上两个碱基？ 拓展思考：两个融合基因之间的限制酶序列 两个基因之间酶切位点： SmaⅠ：CCC↓GGG Sau3AⅠ：↓GATC 拓展思考：两个融合基因之间的限制酶序列 ① SmaⅠ：CCC↓GGG，酶切位点不引起移码突变。； ② Sau3AⅠ：↓GATC，酶切位点引起移码突变。需要在酶切位点后添加 2 个碱基； 思考5:如果中间的限制酶识别序列是5个碱基长度呢？ 答案：需要在限制酶识别序列一端加上一个碱基。 思考6:如何加上这两个碱基呢？ 答案：需要在设计引物的时候在引物的限制酶识别序列一端添加这两个保护碱基。 PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是______。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是______。 1.PCR引物设计：保护碱基 （3）融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是______；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是______。 （4）根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是______。 答案 （3）①促进UBC与FLAG-P的结合 ②P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列 （4）药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目 1.PCR引物设计：保护碱基和kozak序列 1.PCR引物设计：融合基因 某种荧光蛋白（GFP）在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1-GFP融合基因（简称为甲），并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1~E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。 （1）据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是_________。使用这两种酶进行酶切是为了保证______，也是为了保证________