备课素材：5种常用PCR技术 2022—2023学年高二下学期生物人教版选择性必修3

5种常用PCR技术 聚 合 酶 链 式 反 应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。其反应过程包括变性、退火和延伸3 个步骤：双链DNA在高温条件下变性解链；与互补引物退火；在DNA聚合酶作用下，引物链按照碱基互补配对原则延伸，合成一条互补的新链，完成一次循环。经过多次循环扩增，实现目的片段的指数倍增加。该技术自Kary Mullis博士1986年发明，并由美国Cetus公司开发研制至今，随着科学技术的发展和突破，已在农业、医药、食品、环境等多个领域得到广泛应用。 随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多 技术 ，如重叠延伸PCR（gene splicing byoverlap extension PCR，SOE PCR）、等位基因特异PCR（allele-specific PCR，AS-PCR）、热不对称性PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，TAILPCR）、荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR）、锅柄式PCR（panhandlePCR）等。 1． 重叠延伸PCR SOE PCR技术是1989年由Horton等创建的，它依据目的基因的核苷酸序列，将目的基因分为多条引物，设计多对具有互补末端的引物,先分段对模板进行扩增，再将PCR产物混合，通过重叠链的相互搭桥、互为模板而延伸，最终将不同来源的扩增片段重叠拼接起来（图 1）。 重叠PCR技术弥补了一般PCR技术对短于100 bp和长度为几十 bp 片段DNA重组的困难，并可不依赖于内切酶的消化方式，简洁快速地获得PCR产物，有效避免加入的非目的基因序列的连接对目的基因的影响，从而在体外获得高质量的目的基因序列，而且目的产物特异性高，不需要构建DNA文库进行筛选。但由于该技术所使用的引物序列较长（“引发”部分和“重叠”部分，各约25~30 bp），故该技术的退火温度较难把握，对实验的成功率造成很大影响。该技术在大片段基因的人工合成（如图 2-a）、基因定点突变（如图 2-b）等方面有广泛应用。 大片段基因的人工合成是根据目的基因的序列,设计n条单链寡核苷酸片段为引物（如图 2-a 中 P1~P15），相邻近的每2条引物之间均有15~25 bp的序列反向互补。原理是先取中间4条单链的寡核苷酸引物 P6、P7、P8和P9进行第1轮的PCR反应，得到目的片段后进行琼脂糖凝胶电泳回收。下面每轮循环都以上轮的PCR反应产物为模板，依次在两侧引入2 条寡核苷酸引物，互为动态模板，最终实现目的基因的合成。基因定点突变是根据的基因的序列,设计4条单链寡核苷酸片段为引物（如图2-b中的引物A~D），其中2条引物（B、C）碱基序列反向互补，且此2条引物的中间为突变碱基。原理是取引物A、B进行PCR1反应，以及引物C、D进行PCR2反应，得到的2种目的片段分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。将回收的片段混合，片段互为模板和引物进行PCR3反应，最后以PCR3产物为模板，加入引物A、D完成PCR4反应，最终实现基因特定位置碱基的增添、缺失、替换。 2． 等位基因特异PCR AS-PCR又称作ARMS（amplification refractory mutation system），是由Newton等1989年研发的一种PCR技术,该技术的原理是:根据单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP）位点设计3′末端与SNP位点碱基互补或错配的特异PCR引物, 通过凝胶电泳等方法检测PCR扩增产物的有或无, 从而检测基因型中SNP（如图3）。根据等位基因WT和MT之间存在的1个核苷酸T-G的突变，设计引物1、2、3。其中引物1为公共引物，引物2与MT配对，与WT不配对，故引物1、2仅在MT中有扩增产物；同理，引物1、3仅在WT中有扩增产物。由于生物中SNP数量多、分布广、稳定性强，故该技术是一个快速、简便、可靠的检测基因型SNP的技术，也是有效开发SNP分子标记的方法。但该技术的反应体系有很高的灵敏性，对镁离子、Taq酶、dNTP的浓度要求比较严格，实际操作还需要多次预实验予以确定。 图3.等位基因特异PCR原理 3． 热不对称性PCR TAIL-PCR技术是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的PCR技术，该技术由Liu和Whitter于1995年首先研究并报道，其原理是：利用一系列序列特异性的嵌套引物与一个短的简并引物指导扩增已知序列的侧翼序列的反应，由于两类引物的退火温度不同，可通过控制反应过程中的退火温度而有效地控制特异性和非特异性产物的扩增。操作