3.2.2 基因工程的基本操作程序——DNA片段的扩增及电泳鉴定-【爱上生物课】2022-2023学年高二生物优质精讲课件（人教版2019选择性必修3）

第2节 基因工程的基本操作程序 第3章 基因工程 探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 DNA片段的扩增及电泳鉴定 一、实验原理 1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理 ①PCR利用了DNA的______原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够_____________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环； 热变性 调节温度 自动调控温度 30 ②PCR扩增DNA片段还利用了______________的原理； DNA半保留复制 变性 90˚C 延伸 72˚C 复性 50˚C 2.DNA片段电泳鉴定的原理 ①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些________会向着________________的电极移动，这个过程就是_____； 可解离的基团 pH 电场 带电分子 电泳 与它所带电荷相反 ②PCR的产物一般通过_______________来鉴定； ③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、______________和_____等有关 ④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为______的______下被检测出来。 琼脂糖凝胶电泳 凝胶的浓度 染色 300nm 紫外灯 DNA分子的大小 构象 DNA片段的扩增及电泳鉴定 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 凝胶电泳原理示意图 若电泳缓冲液使DNA带负电荷，加样孔侧应连电极的哪一极？负极 二、材料用具 ①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增） ②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所） ③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体） ④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头） ⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等） DNA片段的扩增及电泳鉴定 一次性 吸液枪头 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL 总体积 50μL ⑧PCR反应体系的配方 ⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。(离心管) ⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等 二、材料用具 DNA片段的扩增及电泳鉴定 注：模板DNA的用量为1pg-1ug 使DNA充分变性，以利于引物更好地与模板结合 三、方法步骤 DNA片段的扩增 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min DNA片段的扩增及电泳鉴定 PCR技术 移液 离心 扩增 DNA片段的电泳鉴定 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀 ①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 ③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 ②待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 三、方法步骤 DNA片段的扩增及电泳鉴定 配制 琼脂糖溶液 制备 琼脂糖凝胶 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 DNA片段的电泳鉴定 三、方法步骤 DNA片段的扩增及电泳鉴定 加样 电泳 观察 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块