植物体细胞杂交的选择和鉴定 2021——2022学年高二下学期生物人教版选择性必修三

植物体细胞杂交的选择和鉴定 2020版《课程标准》确实有一条目“概述植物体细胞杂交是将不同植物体细胞在一定条件下融合成杂合细胞，继而培育成新植物体的技术”。2019版高中生物学选择性必修三介绍了植物体细胞杂交的过程及成果： 那么，植物体细胞杂交过程如何选择和鉴定？ 植物体细胞杂交包括原生质体融合和体细胞杂种选择系统。 1.原生质体融合方法 原生质体融合方法有化学融合法和电融合法。 化学融合法根据所用化学试剂的不同，分为硝酸钠融合法、高pH-高浓度钙离子融合法和PEG融合法。其中，PEG融合法由于融合效率高、无种特异性等优点得到广泛应用。电融合法效率高、对原生质体伤害小、融合细胞数易于控制。 PEG融合法的机理：PEG分子具有轻微负极性，可与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键。当PEG分子链足够长时，他在相邻原生质体表面之间，起分子桥作用引发原生质体黏连。PEG还具有改变膜物理化学性质及增加类脂膜流动性的作用，从而促进细胞融合。 PEG融合法的方法：用原生质体培养基调整双亲原生质体的密度，按1:1比例混合；将原生质体混合液移入培养皿中，用滴管缓慢滴加含PEG的混合液；加原生质体培养基离心去上清液，将沉淀物用原生质体培养基重复洗涤两次后进行培养。 2.体细胞杂种选择系统 原生质体融合处理后，混合液中含有未融合原生质体、同核体、异核体等。必须建立一些有效选择体系，从各类型细胞中筛选出杂种细胞，使其在适宜培养基和培养条件下生长、分裂、分化和再生。还需要对杂种植株进一步鉴定，因为在细胞分裂和分化过程中，杂种细胞的染色体常发生复杂变化。 （1）杂种细胞选择 体细胞杂种选择系统由互补选择法和机械选择法。互补选择法又根据双亲互补性状的不同可以分为营养代谢互补选择法、抗性突变体互补选择法和叶绿素缺失突变体互补选择法。 互补选择法： 营养代谢互补选择法原理：杂种细胞具有杂种优势，对培养基适应能力较强。未融合细胞或自体融合的细胞表现的生活力较弱，分化慢，难以再生植株。 抗性突变体互补选择法原理： 杂种细胞的选择是以其对某种逆境具有抗性（必须为显性）基础上进行的。选择培养基为施加某种逆境条件的培养基。例如，在大豆和水稻融合细胞筛选时，利用水稻原生质体耐高温（37℃）的特性，将水稻与大豆原生质体融合细胞培养在适合大豆原生质体生长的培养基，但培养温度为37℃。 叶绿素缺失突变体原理： 杂种细胞的选择是基于融合细胞具有正常叶绿素并在特定培养基上生长的基础上进行的。选择培养基为适合白化和杂种细胞增殖的培养基。白化亲本原生质体和杂种原生质体能形成愈伤组织。 机械选择法： 利用融合细胞所具有的可见标记，在倒置显微镜下，用微管将融合细胞吸取出来进行选择的方法。常用的可见标记是叶肉细胞的绿色。 （2）杂种植株鉴定 杂种细胞筛选仅为体细胞杂种真实性的间接证据，需要对所获得的杂种植株作进一步鉴定。因为体细胞杂种在融合及杂种植株再生过程中常常发生遗传变异，表现在细胞分裂和染色体的数目的不稳定性及杂种植株的不育性。 杂种植株鉴定的方法有形态学鉴定、细胞学鉴定、同功酶鉴定和DNA分子标记鉴定。其中，鉴定杂种植株最有效的方法DNA分子标记鉴定。 DNA分子标记鉴定 是在DNA水平上对亲本和杂种植株遗传差异进行鉴定的一种技术。DNA分子标记鉴定技术能准确鉴定出生物个体间核苷酸序列间的差异，甚至是单个核苷酸的变异，成为鉴定杂种植株最有效的方法。已发展出十几种DNA标记技术，如RFLP、RAPD、AFLP等，它们各具特色，为不同的研究目标提供了丰富的技术手段。 RAPD技术 1990年发明并发展起来的，RAPD是建立在PCR基础之上的一种可对整个序列的基因组进行分析的分子技术。其以DNA为模板，以单个人工合成的核苷酸序列为引物，进行PCR 扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、亚甲基蓝染色后，在紫外透视仪上检测。 它的应用是基于这样的一个推理：对于不同的模板DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的带谱（模板基因组间可能具有同源性），也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。 事实上，不同基因组DNA总是具有一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。理论上讲，在一定的扩增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。 例、甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究。基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题： （1）根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备