第07讲 重组DNA技术的基本工具-【寒假自学课】高二生物寒假提升精品讲义（人教版2019选择性必修3）

第07讲 重组DNA技术的基本工具 【学习目标】 1.阐明重组DNA技术所需的三种工具的作用。 2.提升对基因工程的理解能力，能够合理分析在基因水平产生的问题。 3.了解进行DNA的粗提取和鉴定的原理，进行DNA的粗提取和鉴定的操作。 3.认同基因工程的作用及意义，认识到生物技术的发展离不开理论研究和技术创新。 【基础知识】 一、基因工程的概念 项　目 具体内容 操作对象 基因 原　理 基因重组 操作环境 体外 操作水平 分子水平 结　果 获得人们需要的新的生物类型和生物产品 优　点 克服远缘杂交不亲和的障碍;定向改造生物的性状 二、限制性核酸内切酶 （1）来源：主要从原核生物中分离出来。 （2）种类：约4000种 （3）作用:识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 （4）限制酶识别序列的长度最常见的为6个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个、或其他数量的核苷酸组成。 ①在中轴线两侧切割，形成黏性末端。如：EcoRI限制酶能识别GAATTC序列，为6个核苷酸，并在G和A之间切开。 ②在中轴线处切割，形成平末端。如：Sma I限制酶能识别CCCGGG序列，为6个核苷酸，并在G和C之间切开。 总结归纳 1.限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。 2.限制作用实际就是限制酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。一般不切割自身的DNA分子，是由于甲基化的修饰作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保护，通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。 3.根据酶的功能特性、大小及反应时所需的辅助因子，限制性内切酶可分为两大类，即I类酶和Ⅱ类酶。 其中，Ⅱ类酶有EcoR I、BamH I、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ等，在所识别的特定碱基序列上有特定的酶切位点，因而DNA分子经过Ⅱ类酶作用后，可产生特异性的酶解片断，这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。 4.限制酶识别DNA序列中的回文序列。回文序列指的是双链DNA或RNA分子中的特定的核苷酸片段，该片段在其中一条链上按5'到3'读取的序列与其互补链上按相同的5'到3'读取的序列一致。例如，DNA序列ACCTAGGT之所以是回文序列，是因为它的互补序列是TGGATCCA，而反向互补序列是ACCTAGGT，和其原来序列一致。有些限制酶的切割位点在回文的一侧（如EcoR I、BamH I、Hind等），因而可形成粘性末端；另一些Ⅱ类酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal Ⅲ、HPa I、Sma I等，切割位点在回文序列中间，形成平末端。 三、DNA连接酶 (1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。即把脱氧核糖和磷酸交替连接而构成的DNA骨架上的缺口连接起来。 (2)类型： 归纳总结 1.DNA连接酶分为两大类:一类是利用ATP 催化两个核苷酸链之间形成磷酸二酯键的依赖ATP的DNA 连接酶；另一类是利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+) 的能量催化两个核苷酸链之间形成磷酸二酯键的依赖NAD+的DNA 连接酶。DNA连接酶是通过催化形成磷酸二酯键把两条DNA（双股或是单股DNA）黏合成一条。 2.教材中提到的E·coliDNA连接酶，来源于大肠杆菌，可用于连接粘性末端；T4DNA连接酶，来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率低。E·coliDNA连接酶对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部分活性，可以催化酶与NAD(而不是ATP)反应形成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。T4DNA连接酶是ATP依赖的DNA连接酶，催化两条DNA双链上相邻的5′磷酸基和3′羟基之间形成磷酸二酯键。 四、基因进入受体细胞的载体 （1）载体作用：将目的基因载入受体细胞。利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。 （2）载体种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等 （3）最常用载体：质粒 特点： ①裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA外，具有自我复制能力的环状双链DNA。 ②有一个至多个限制酶切割位点。 ③在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 ④有特殊的标记基因，如：抗生素的抗性基因（四环素抗性基因(tetr)、氨苄青霉素抗性基因(ampr)等）、荧光蛋白基因（绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)。 ⑤对细胞无毒无害。 ⑥大小适中，便于提取和操作。 归纳总结 1.基因工程中常用的