备课素材：“探究pH对酶活性影响” 的探究实验设计2022-2023学年高一上学期生物人教版必修1

“探究pH对酶活性影响” 的探究实验设计 “探究pH对酶活性影响”实验是人教版高中生物学必修1第五章第1节“影响酶活性的条件”探究实践的内容。 学生已学会应用分光光度计定量测定的方法，能基于实验结果绘制曲线，并用文字描述温度对酶活性的影响规律。在此基础上，学生提出问题：怎样获得酶的最适pH范围？ pH对酶活性有怎样的影响？为此，教师引导学生结合教材的实验原理,设计pH对植物过氧化氢酶活性影响的实验探究方案。通过定性观察实验,初步了解环境酸碱度会影响酶活性;通过定量测定实验，归纳pH对酶活性影响的规律。 1.探究方案 1. 1实验原理 过氧化氢酶广泛存在于植物的所有组织中,能将过氧化氢分解为氧和水，可使生物机体免受过氧化氢的毒害作用。钼酸铵能够中止过氧化氢酶催化过氧化氢分解的反应，并与反应体系中剩余的过氧化氢结合，形成稳定的黄色络合物，该物质在405 nm处有吸收峰，其颜色的深浅与酶活性成反比。因此,可通过测定反应物在405 nm处吸光度值，推算过氧化氢酶的活性。 1.2实验材料与器具 恒温水浴锅、冷冻离心机、酶标仪、移液器、离心管、记号笔、土豆、过氧化氢酶（CAT测定试剂盒（钼酸铵法）、不同pH的磷酸盐缓冲液、3%过氧化氢溶液、双蒸馏水。 1.3实验探究步骤 实验探究步骤如下： （1） 制备过氧化氢酶粗提液。 将若干个土豆及pH 7. 8磷酸盐缓冲液2 mL加入榨汁机，获得土豆汁;将土豆汁分装至2mL离心管中，于冷冻离心机中，12000 rpm离心15 min;取上清液，即为过氧化氢酶粗提液。 （2） 制备不同pH条件下过氧化氢酶溶液。 取不同pH（pH 2、5、7、9、13）的磷酸盐缓冲液1. 8mL,分 别与0.2 mL过氧化氢酶粗提液混合，并置于冰上备用。 （3） 观察法探究pH对酶活性的影响。 实验设置5个pH组：pH2、5、7、9、13。每组加入3%过氧化氢溶液2mL,及不同pH条件下的过氧化氢酶溶液0. 1mL,混匀；对照组加入3%过氧化氢溶液2mL及双蒸馏水0. 1mL;观察并记录实验现象（表1）。 （4）过氧化氢酶活性定量测定。 实验组各取步骤（2）中的过氧化氢酶溶液，参照过氧化氢酶（CAT）活性测定试剂盒使用说明的方法,测定过氧化氢酶活性（表 2）。 （5）过氧化氢酶活性计算。 测定各组反应物在405nm波长条件下的吸光度值（OD），重复多次取平均值并记录;参照CAT活性测定试剂盒的使用说明，按公式：待测酶活性（U/mL）=（对照组OD值-实验组OD值）X271X稀释倍数/（60X取样量），计算酶活性并记录。 2. 结果与讨论 教师组织学生根据实验结果，开展分析、讨论与交流。 2.1定性观察实验 学生根据表1,得出结论：过氧化氢酶在pH7时产生的气泡最多;pH9和pH5产生的气泡较多;pH2和pH13产生的气泡最少。说明pH会影响酶的活性,随着pH逐渐增加或减少，酶的活性都会逐渐降低甚至失活。 2.2定量测定实验 以pH为横坐标、酶活力为纵坐标，利用Excel软件绘制柱形图（图1）。 学生根据图1，得出结论：pH7时，过氧化氢酶有较高的催化活性;小于pH 7时，酶的活性随pH降低而降低;大于pH7时，酶的活性随pH升高而降低。基于上述科学事实，有利于学生构建“酶活性受pH影响”的生物学概念。 2.3拓展研究 教师组织学生进一步思考：pH影响酶活性的机理是否与温度影响酶活性的机理一致？强酸和强碱影响酶活性的机理是否相同？若将植物种植在不同pH条件下，植物细胞内过氧化氢酶的最适pH是否会发生变化？请学生利用课余时间进一步设计并实施实验。 3. 小结 3. 1降低误差、提高效能 为了尽可能减低实验误差、提高实验效能,教师做了以下处理：①实验材料方面：采用直径约2 cm大小及生长状况相似的土豆放入榨汁机研磨。不但较好地控制变量，也避免因土豆过大，切割处理后 造成机械损伤影响实验结果；采用榨汁机获取过氧化氢酶粗提液，研磨充分，有利于快速破碎土豆细胞，减少因耗时久，土豆汁氧化导致实验误差。②实验试剂方面：利用不同pH的磷酸缓冲液，有利于维 持溶液及反应环境pH的相对稳定；利用过氧化氢酶活性测定试剂盒，更准确、简便、高效地测定出氧化氢酶活性。 3.2与其他方法的比较 除上述方法外，目前测定过氧化氢酶活性的主要方法有高锰酸钾滴定法、碘量滴定法、氧电极法和分光光度法等。高锰酸钾滴定法的 滴定终点显示高锰酸钾的浅红色,判断比较困难（显色不稳定），耗时多，重复性差;需要在足够的酸性环境中进行,这样过氧化氢和高锰酸钾都会随时间逐渐分解。 碘量滴定法的滴定终点易受pH影响发生变化，而且硫代硫酸钠易损耗。氧电极法的原理是通过测量放氧速度推算出过氧化氢酶活性。虽然方法灵敏快速, 但需要