3.2 基因工程的基本操作程序 第3课时 目的基因的检测与鉴定进和DNA片段的扩增及电泳鉴定实验课件【新教材】2020-2021学年人教版（2019）高中生物选择性必修三

基因表达载体的构建（核心） 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 目的基因的筛选与获取 基因工程的基本操作程序 问题探讨 1.标记基因筛选呈阳性一定能确定转基因生物培育成功了吗？ 2.导入的基因表达载体一定能维持稳定和表达出遗传特性吗？ 1.不一定，导入的还可能是空载体、载体-载体连接物，标记基因筛选也是呈阳性，因此仅凭标记基因有无，无法完全确定转基因生物是否培育成功； 2.也不一定，需要进行目的基因的检测与鉴定； 四、目的基因的检测与鉴定 1.目的 ①检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性； ②检查转基因生物是否培育成功； 2.目的基因的检测与鉴定方法 类型 检测内容 方法 分子水平的检测 个体生物学水平的鉴定 受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 目的基因是否转录出了mRNA PCR等技术 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原-抗体杂交技术 表达产物是否具有生物学活性（个体是否具有相应性状） 抗性测定、个体性状测定等 补充了解—分子杂交技术 在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA或mRNA杂交，若出现杂交带，则目的基因插入成功或转录出mRNA 补充了解—抗原-抗体杂交技术 从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质 补充思考： 1.在抗原-抗体杂交中，目的蛋白是作为抗原还是抗体？ 2.个体生物学水平的鉴定具体有哪些做法？ 抗原 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）感染（抗病接种实验） 未侵染上病斑 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 补充思考： 3.以上几种方法的顺序是如何的？ 补充思考： 4.如何利用PCR技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因和目的基因是否转录出mRNA？ ①提取受体细胞的DNA，设计一对引物，可以一个与染色体DNA互补结合，另一个引物与目的基因互补结合，这样只有以重组DNA为模板才能获得扩增产物（也可以都跟目的基因互补结合，这样只有含有目的基因，才能获得扩增产物），之后再进行电泳检测； ②提取受体细胞的mRNA，进行逆转录，获得cDNA，用上述方法进行PCR扩增，之后再进行电泳检测； 如何进行电泳检测呢？ 五、DNA片段的扩增及电泳鉴定 （一）实验原理 1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理 ①PCR利用了DNA的______原理，通过________来控制__________________，PCR仪实质上就是一台能够___________的仪器 ②PCR扩增DNA片段还利用了____________的原理； ③一次PCR一般要经历___次循环； 热变性 调节温度 DNA双链的解聚与结合 自动调控温度 DNA半保留复制 30 *复性时不一定均为引物与DNA模板结合，也存在DNA解开的两条单链的结合，因此一般在PCR实验中引物的投入量远大于产物量（但不能随意加大浓度）； 2.DNA片段电泳鉴定的原理 ①DNA分子具有___________，在一定的___下，这些基团可以带上______________，在_____的作用下，这些________会_____________________________，这个过程就是_____； ②PCR的产物一般通过_____________来鉴定； ③在凝胶中DNA分子的迁移速率与_____________、______________________________________等有关*； ④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为_____的______下被检测出来。 可解离的基团 pH 正电荷或负电荷 电场 带电分子 向着与它所带电荷相反的电极移动 电泳 琼脂糖凝胶电泳 凝胶的浓度 DNA分子的大小和构象（迁移速率与之呈负相关） 染色 300nm 紫外灯 （二）材料用具 1.试剂 ①无菌水、琼脂糖 ②电泳缓冲液（TAE或TBE） ③凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝） ④核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭） ⑤PCR反应体系的配方 PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28-33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1-2U 模板DNA